• 探讨CD28家族受体对慢性HBV感染的影响及其机制的-论文

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论文导读:

摘要:T细胞功能耗竭是持续性HBV感染的一个重要特征。长期的大量的抗原刺激是导致CHB患者T细胞功能耗竭的一个重要原因,研究表明CD28家族抑制性受体,特别是PD-1在慢乙肝患者耗竭的CD8+T细胞上的表达增加。CD28家族包含两个协同刺激性受体(CD28和ICOS),三个抑制性受体(PD-1、CTLA-4和BTLA)。CD28家族五个受体具有同源性,在结构上具有类似特征,且都是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。尽管这些受体在HIV和HCV持续感染已有大量的研究,但在持续性HBV感染中的作用研究相对较少,所积累的临床科研资料更是匮乏。本研究拟以整个CD28家族作为研究对象,探讨它们在持续性HBV感染中外周血T细胞上表达状况及与血清病毒学指标的相关性,以及体外阻断PD-1:PD-L1路径对HBV持续性感染患者CD4+和CD8+T细胞CD28家族受体表达的影响和T细胞功能的影响。本研究对探讨新的慢乙肝的免疫治疗方法将具有重要意义。目的1.本研究期望通过对CD28家族中的受体(CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4和BTLA)在HBV持续性感染患者外周血T细胞上表达状况进行研究,并分析这些分子的表达与CHB患者血清病毒学指标的相关性。2.通过体外阻断PD-1:PD-L1路径,PBMC在体外培养并用HBV特异性多肽,即HLA-A2限制性多肽(AA,18-27,FLPSDFFPSI)刺激,确定阻断前后HBV持续性感染患者CD4+和CD8+T细胞CD28家族受体表达情况变化,根据表达量的变化,判断阻断效果并结合临床指标来评价CD28家族中的受体对HBV持续性感染患者T细胞功能耗竭的影响。3.根据阻断后T细胞表达效应细胞因子IFN-γ及mRNA水平上表达的转录因子T-bet和GATA-3综合判定PD-1:PD-L1路径阻断对CHB患者T细胞功能的影响。探讨CHB患者T细胞功能耗竭的可能机制,并从总体上阐明CD28家族中的抑制性受体在持续性HBV感染中的作用。为我们将来找到治疗HBV持续性感染手段提供一定的参考。方法1.总共48位来源于协和感染性疾病科慢性乙肝患者和26位健康者参与这项研究。2.肝素抗凝管采取新鲜血液,用泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)密度梯度离心法分离PBMC。分离后的PBMC立即染色进行表型分析。3.分离后的部分PBMC在96孔(2×105/孔)圆底板上培养10天,并根据需要加入HBV特异性多肽,即HLA-A2限制性多肽(AA,18-27, FLPSDFFPSI)刺激,并加入Anti-PD-L1用于阻断PD-1:PD-L1路径,实验中还需另外加入同型质控抗体作为对照。培养后的细胞用于一部分用于流式检测CD4+和CD8+T细胞表面CD28家族受体(CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4、BTLA)和胞内效应细胞因子IFN-γ的表达;部分PBMC用real-time PCR定量检测总体的mRNA水平上T细胞转录因子:T-bet和GATA-3表达。4.用商业化的酶联免疫分析试剂盒检测血清学标志物:HBsAg、 anti-HBsAg、HBeAg、anti-HBeAg、anti-HBcAg、anti-HIV (1/2型)、anti-HCV、 anti-HDV;用PCR方法进行HLA-A2型别的鉴定;血清中的HBV-DNA用实时定量PCR (real-time PCR)进行定量。5.统计学分析采用非参数Mann-Whitney, Wilcoxon matched pairs检验和Spearman correlation coefficient检验。结果1.CD28家族受体总体表达谱不同于健康对照组:相对于正常对照,CHB患者的CD4+T细胞的PD-1、CTLA-4和CD8+T细胞上的ICOS、PD-1和BTLA均显著升高。2.CHB患者和健康对照相比,CD28家族同一受体在CD4+和CD8+T细胞上表达的相关性存在差异:CD28、ICOS、PD-1在CHB患者CD4+与CD8+T细胞上的表达表现为正相关,但在健康对照组上CD4+与CD8+T细胞上的表达不相关。但BTLA在健康对照和CHB患者的CD4+与CD8+T细胞上的表达均表现出很好的正相关。3.CHB患者和健康对照相比,CD28家族不同受体在同一CD4+或CD8+T表达之间的表达存在差异:CD28与CTLA-4在CHB患者CD4+上的表达成负相关,但在健康对照CD4+T细胞上的表达不相关;ICOS与PD-1在CHB患者和健康对照上CD4+T细胞上均表现为正相关;CD28与BTLA在CHB患者CD8+上的表达和健康对照CD8+T细胞上的表达上均成正相关。4.CHB患者CD8+T细胞上的ICOS、PD-1和BTLA的表达和患者血清中的HBV DNA载量存在相关性,即:HBV DNA载量分别与PD-1、BTLA成正相关,而与ICOS成负相关。5.CHB患者CD4+和CD8+T细胞在体外PD-1:PD-L1路径阻断后:(1)总体的CD28家族受体的表达谱发生显著改变,CD4+细胞上CD28、ICOS. PD-1、CTLA-4的表达显著上调,且CD4+T细胞上的CD28和ICOS倍数改变成正相关,CD4+T细胞上的CTLA-4分别同CD28、ICOS、PD-1均成正相关。但CD8+T细胞上CD28家族受体的表达没有显著变化。另外,PD-1:PD-L1路径阻断后CD4+细胞上PD-1的表达与HBV DNA载量成正相关。(2)CD4+胞内IFN-γ表达升高,且其倍数改变与阻断后CD4+T细胞上ICOS表达的倍数改变成正相关,而与CD4+T细胞上PD-1表达的倍数改变成负相关;CD8+T细胞在PD-1:PD-L1路径阻断后,胞内IFN-γ表达没有显著改变。(3)总体的PBMC转录因子T-bet和GATA-3mRNA表达上调,且两者的倍数改变成正相关,但T-bet的倍数改变更为明显;PD-1:PD-Ll路径阻断后,T-bet:GATA-31.3时,CD4+T细胞胞